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强化血糖、血压控制对糖尿病足患者外泌体效应microRNA的影响

2021-04-09 08:34:54 右江医学 2021年2期
关键词:糖尿病足血压血糖

王琳 曾娜 谢玮平 蒋月莲 李政 唐丽珠 隆采丹 吴标良

【摘要】?目的?观察糖尿病患者治疗前后血外泌体分泌及效应因子miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平变化,探讨强化血糖、血压控制对糖尿病足溃疡创面愈合的作用机制。方法?30例糖尿病足患者分别于强化治疗1周前后采血,抽提外泌体,行外泌体鉴定,观察外泌体分泌情况并测定miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平。结果?强化血糖、血压治疗后,糖尿病足患者血外泌体miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平升高(P<0.05);相关性分析显示miR-126-3P水平与空腹血糖(FBG)呈正相关关系(r=0.37,P<0.05)。结论?强化血糖、血压控制可升高糖尿病足患者外泌体miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平,可能对糖尿病足溃疡创面愈合具有积极意义。

【关键词】?血糖;血压;糖尿病足;外泌体;microRNA

中图分类号:R587.2???文献标志码:A???DOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2021.02.004

【Abstract】?Objective?To observe serum exosomes secretion and the changes of levels of mir-126-3p and mir-125b-1-3p in diabetic patients before and after treatment, and to explore the mechanism of intensive blood glucose and blood pressure control on the wound healing of the diabetic foot ulcers. Methods?Blood collection, exosomes extraction and identification were respectively performed on 30 patients with diabetic foot before and after intensive treatment for 1 week. Exosomes were extracted and identified. And then, the secretion of exosomes was observed and the levels of miR-126-3p and miR-125b-1-3p were measured. Results?After intensive blood glucose and blood pressure treatment, blood exosomes miR-126-3P and miR-125b-1-3p levels in diabetic foot patients increased (P < 0.05); and correlation analysis showed that miR-126-3P levels were positively correlated with fasting blood glucose (FBG) (r = 0.37, P < 0.05). Conclusion? Intensive blood sugar and blood pressure control can increase the levels of exosomes miR-126-3P and miR-125b-1-3p in diabetic foot patients, which may have positive significance for the wound healing of diabetic foot ulcers.

【Key words】?blood sugar; blood pressure; diabetic foot; exosomes; microRNA

糖尿病的發病率逐年升高,包括糖尿病足(diabetic foot,DF)等在内的并发症相应增加[1]。目前尚不清楚糖尿病足溃疡创面的愈合机制。外泌体可被多种细胞类型释放在血液和其他体液中,是一种易获取、性质稳定且无创性的代谢性疾病生物标志物[2~3]。外泌体中包含的小分子核酸MicroRNAs (miRNAs)是一类广泛的小型非编码RNA,主要通过与信使RNA靶点的编码区和非编码区的互补序列相互作用来抑制基因表达和蛋白质翻译过程,在目标组织中可调节炎性胰腺细胞、促进血管内皮细胞再生,并影响胰岛素信号、代谢信号、细胞存活周期等[4],从而影响疾病的发生与进展。目前已有研究表明外泌体miR-126-3P、miR-125b-1-3p在慢性溃疡创面愈合中具有积极意义[5~6],本实验拟通过观察强化血糖、血压控制对miR-126-3P、miR-125b-1-3p的影响,探讨强化血糖、血压控制对糖尿病足溃疡创面愈合的作用机制。

1?对象与方法

1.1研究对象?收集自2019年6月~2020年5月在右江民族医学院附属医院住院的30例2型糖尿病足(T2DMF)患者作为研究对象。2型糖尿病(T2DM)的诊断及分型标准以1999年世界卫生组织(WHO)指南为准[7];糖尿病足参照“糖尿病足防治国际指南(2019)”诊断[1]。收集患者一般信息及临床试验指标,采集治疗前后血液标本供检测。

1.2?强化治疗方案?强化血糖、血压控制目标:空腹血糖(FBG)4.4~6.1 mmol/L,餐后2小时血糖(2 h PBG)4.4~8.0 mmol/L;血压(SBP/DBP)≤130/80 mmHg[8]。

1.3?样本采集及鉴定?采集治疗前后血液标本,exoEasy试剂盒提取外泌体、Western Blotting法检测外泌体特征蛋白CD9、CD63。用exoEasy试剂盒提取外泌体后将样本冻存。Western Blotting实验:将待测样品剪碎、研磨,置于离心管中,加入RIPA裂解液(北京索来宝企业)进行充分裂解,提取总蛋白并使用ECL发光试剂盒(中杉金桥企业)测定总蛋白浓度。先用10% SDS-PAGE凝胶电泳分离一定量的蛋白质,再注入等体积蛋白上样,依次经过电泳、转膜、封闭后置于4℃冰箱中保存一夜,在孵育一抗和二抗以后,用PBST洗涤3次,并曝光显影;最后用Image JApp分析图像计算蛋白灰度值。

1.4?Real Time PCR技术检测miR-126-3P、miR-125b-1-3p表达水平?外泌体鉴定完成后提取样本总RNA,使用miRcute miRNA第一链cDNA合成试剂盒和miRcute miRNA(SYBR Green)试剂盒(均由天根生物科技有限企业提供)将RNA反向转录为互补的cDNA,并以cDNA为模板进行PCR扩增实验。此实验以U6为内参,各样品微小RNA表达量用U6表达量进行归一化处理,最后用荧光定量PCR仪,用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。本实验中的microRNA加尾法单向引物序列分别为miR-125b-1-3p:5′-ACGGGTTAGGCTCTTGGGA-3′,miR-126-3P:5′-TCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3′,內参U6:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。

1.5?统计学方法?采用SPSS 26.0和 GraphPad Prism 7App进行统计分析和数据可视化处理。符合正态分布数据以均数±标准差(±s)表示,治疗前后数据比较采用配对t检验。正态分布资料间的相关性采用Pearson相关分析。以α=0.05为检验水准,双侧检验。

2?结??果2.1?相关临床指标比较?本次收集的糖尿病足患者年龄在35~70岁之间,男性17例,女性13例,糖尿病足病程为1个月~1年。强化治疗前后的FPG、2 hPBG、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2?血清外泌体鉴定?抽提患者强化治疗前后的血清外泌体,通过Western Blotting法均可检测到外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101,表明抽提物质为外泌体。见图1。

2.3?强化治疗前后血清外泌体?治疗后miR-126-3P、miR-125b-1-3p表达水平较治疗前显著升高,比较差异有统计学意义(P<0.001)。见表2、图2、图3。

2.4?强化血糖控制前后相关临床指标与目的microRNAs表达水平的相关性分析?将治疗前后的FPG、2 hPBG、SBP、DBP和miR-126-3P、miR-125b-1-3p水平之间的相关性采用Pearson相关性分析,结果显示治疗后空腹血糖水平与miR-126-3P表达水平呈弱正相关关系(r=0.37,P<0.05)。见图4、图5。

3?讨??论

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)主要有四大类,其分类按大小、亚细胞来源和含量,可分为膜颗粒、微泡、外泌体和凋亡小泡[9]。外泌体是直径大小在30~100 nm之间的有脂质双分子层膜包裹的细胞外结构,其功能具有调节细胞间通讯的作用[10],因此近年来也被作为糖尿病诊断的一种新型生物标志物[11]。

外泌体携带的众多物质中,microRNAs受到广泛关注。有研究已证实一些microRNAs在啮齿动物的糖尿病中可作为特殊的生物标志物,例如,miR-24、miR-126、miR-146与糖耐量异常有关;miR-122、miR-210、miR-133与疾病进展相关;miR-21-5p与炎症发生相关[12~13]。在众多动物实验中发现miR-126-3P、miR-125b-1-3p有抑制炎症和促进血管再生的作用[5,14~15]。本次实验发现强化血糖治疗后,糖尿病足患者的血清miR-126-3P、miR-125b-1-3p基因表达量与治疗前有显著差异,且表达量均升高,观察到这两种基因的高表达促进了糖尿病足溃疡面的愈合,其可能的机制与表观遗传机制相关。有研究表明[16],在糖尿病足这一并发症中,高血糖、炎症因子和氧化应激等因素,可以调节表观遗传机制,影响靶细胞中miR-126-3P、miR-125b-1-3p等基因的表达,从而影响糖尿病足的发展与预后。可能参与的信号通路有细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路,miR-126-3P参与下调磷脂酰肌醇-3激酶调节亚单位2(PIK3R2),并激活PI3K,介导Akt/PKB的磷酸化,促进外周血管再生,从而影响糖尿病足创面的愈合和控制疾病进展。本实验还发现空腹血糖水平与miR-126-3P表达水平呈弱正相关关系,有关研究表明[17],胰岛素受体底物(IRS-1)表达也可被miR-126-3P抑制,从而减少胰岛素的抵抗,有利于机体调控血糖代谢水平,这为将miR-126-3P基因作为新型生物标志物用于糖尿病代谢治疗提供了科学依据。

本实验发现在高血糖环境中miR-125b-1-3p的表达下调,糖尿病足患者其微血管内皮细胞的功能随miR-125b-1-3p的升高而受到保护。且通过强化血糖、血压的控制,miR-125b-1-3p表达上调后,炎症反应被抑制,从而促进新生血管再生,有利于创面愈合,但其具体的作用机制有待于进一步研究。

综上所述,强化血糖、血压控制可上调miR-126-3P、miR-125b-1-3p基因的表达,这可能是强化代谢治疗促进糖尿病足溃疡创面愈合的原因之一。本实验受样本量少的限制、采血间隔周期短及个体差异大等因素的影响,对临床资料与miR-126-3P、miR-125b-1-3p表达水平关系作出的结论有一定限制性。针对以上不足,还有待在进一步的研究中加以改进和证实。

参 考 文 献

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(收稿日期:2020-09-03?修回日期:2020-11-16)

(编辑:王琳葵?梁明佩)

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